その50
もう一度ギガプレをすることになりました。
目的
大腸菌を大量に培養する。
実験手順
1.この前といっしょです。
ただし、前回は5Ｌの三角フラスコで2Ｌ培養しましたが
今回は10本の坂口フラスコ250ｍｌで2.5Ｌ培養しました。
また、ＬＢ培地よりもさらに栄養のある「2×ＹＴ」という
培地を用いました。
1Ｌの2×ＹＴの組成
・トリぷトン 16ｇ
・イースト 10ｇ
・塩 5ｇ
2.あと先週のギガでプラスミドが450μｇしか採れなかった
と言いましたが、またエタ珍して測ったところ、1.84ｍｇ
採れてたことがわかりました。
3.終了
感想
ギガがんばります。
ミニプレだと10μgくらいしかとれない。
ギガだとその100倍くらい。
ギガというほどとれていないぞよ。
改名せい！
「キロプレップ」とか。
mini=10^7というならいいけど。
でもどう考えてもミニじゃない。
モーニング娘。とミニモニを「ミニ」
の基準とおけばだいたい15/16倍といったところか。
全然ミニじゃねぇー。
そんだら最初からメガプレップといえー。
ペタプレップとかだとどのくらい取れるんだろ…。
２の15乗？少なくとも㌔単位だな。
山上会館は何時からなんですか？
また，何時までなんでしょうか．
私，急遽バイトが入って山上会館には
行かないことにしたのですが，できる
ことならお酒の一杯くらい飲みたいと
思っています．
６時半には本郷にいると思うのですが
何時までなんでしょうか．
去年は８時くらいまでやっていた記憶があります．
たしか５時３０分からかな。
何時までやってるかは
知りません。
まえだし、
まさかモルモットに
なりにいってくるんすか？
いいなぁ。
ベルぎー引き分けたっす。
ベルぎーに勝ってほしかった・・・
西郷先生はチュニジアを応援して
いるそうです．
昨日は日本がロシアに勝って大変不機嫌だ
と言っていました．
僕は、ろしあ嫌いです。
日本先制
いえーい
すごいしゅごい！！
うおりゃー！明日のゼミ論文やってねぇー！
いえい
戸田が上手いのか審判が下手なのか。それとも、あのぐらいではファールとはみなさないのか。
もすくわでは日本人は目立たないようにとお触れが出てたらしいです。
実際、試合が終わった後、日本人が襲われたらしい。
川村氏、W杯の時にロシアじゃなくて韓国でよかったね。
カワムラ氏！、
ロシアに行ったら
殺されるあるよ！！
ここは、せめて
「アイ アム ア チャイニーズ」作戦
で行きましょう。
明日の日本戦、控え室で応援しましょう！
田中センセ、学校にきてくださいな。
昨日ハンズにいって国旗買ってきちゃいました。
10本750円。
小学生が工作で作るようなやつですが、
旗を振りフリ応援しましょう！！
まじっしゅか？
日曜出勤はちょっと・・・
日本が負けてもいいのですか！！
だいじょう～ぶ
まぁ、2－0で勝つっすよ。
とりあえず、もう一度プラスミドの大量調製を
行わなきゃいかんのですが、どのやり方で
やろうか迷ってます。やはり、前日使った
ギガプレはだめだなぁ。やはり、兆遠心しかないのかな。
あのエチブロ使うのは、ヤダけど。
まぁ、ギガプレは1回12000円かかることを考えれば、
超遠心は格安だし、おすすめらしい。
目的
昨日採れたプラスミド溶液をエタ珍する。
実験手順
1.エタ珍する。
2.自分のＴＥ溶液（10ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ ｐＨ8.0、
１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ8.0）を作る。昨日は岡部さんのを
もらった。
3.エタ珍後、ＴＥ溶液に溶かし零下80℃で保存。
4.終了
感想
ＤＮＡがなんとＴＥ溶液に溶けない！！！！
ＤＮＡが絡まっている可能性が高いらしい？
しかし、プラスミドが絡まるってありうるの？
やはり、ギガはダメです。もういやだ・・・
しかし、超遠心もダメかもしれません。
渡辺さん（ボクが引き継いだ人）は、当初
超遠心でやって全然採れなかったため、ギガで
やることにしたらしい。
要は、根性でやるしかないっす。
今日は、いよいよギガプレで
プラスミドを大量調製だぁ！
目的
QIAfilter Plasmid Giga Protocolで
プラスミドを大量調製。
実験手順
1.Harvest the bacterial cells by centrifugation
at 6000×g for 15 min at 4℃.
2.Screw the QIAfilter Giga Cartridge onto a 45 mm-neck
glass bottle and connect it to a vacuum source.
3.Resupend the bacterial pellet in 125 ml Buffer P1.
4.Add 125 ml Buffer P2, mix gently but thoroughly by
inverting 4-6 times. Mix well until white, fluffy
material has formed and the lysate is no longer
viscous. Proceed directly to step 8. DO not incubate
on ice.
5.Pour the lysate into the QIAfilter Giga Cartridge and
incubate at room temperature for 10 min.
6.Switch on the vacuum source. After all liquid has
been pulled through, switch off the vacuum source.
Leave the QIAfilter Cartridge attached.
7.Add 50 ml Buffer FWB to the QIAfilter Cartridge and
gently stir the precipitate using a sterile spatula.
Switch on the vacuum source until the liquid has
been pulled through completely.
8.Equilibrate a QIAGEN-tip 10000 by applying 75 ml
Buffer QBT and allow the column to empty by gravity
flow.
9.Apply the filtered lysate from step 10 onto the
QIAGEN-tip and allow it to enter the resin by
gravity flow.
10.Wash the QIAGEN-tip with a total of 600 ml Buffer
QC.
11.Elute DNA with 75 ml Buffer QF.
12.Precipitate DNA by adding 52.5 ml room-temperature
isopropanol(0.7 volumes) to the eluted DNA. Mix, and
centerifuge immediately at 15,000×g for 30 min at
4℃. Carefully decant the supernatant.
13.Wash DNA pellet with 10 ml of room-temperature 70%
ethanol, and centrifuge at 15,000×g for 10 min.
Carefully decant the supernatant without disturbing
the pellet.
14.Air-dry the pellet for approximately 10-20 min, and
redissolve the DNA in a suitable volume fo buffer.(
e.g., TE, pH 8.0 or 10 mM Tris-CL, pH 8.5)
15.採れたＤＮＡ溶液を一部採り、希釈して吸光度を測ったところ
理論値では、10ｍｇ採れるはずのところ、実際は450μｇしか
採れなかったことが判明する。
16.ショックで控え室で一晩寝る。
感想
ギガプレのばかやろう～
ボクの内々定が決まった会社の株価が
ここ1週間で1.5倍以上に跳ね上がってる・・・
民主党は、正味の自己資本はすでに赤字と試算してたけど
なんとかがんばってほしい。
目的
ミニプレでちゃんとプラスミドに目的遺伝子が入っているか
確認し、いよいよギガプレに植え継ぎを行う。
実験手順
1.まず前日四本の試験管に培養していた菌がちゃんと
成長してるか確かめた後、新たな試験管（安否四厘入り）
四本に5μｌずつ、もう1度植え継ぎを行って培養する。
（これは、この後行うミニプレが成功してたとき、
ギガプレに使用するために行いました）
2.ミニプレを行う。まず前日の四本の試験管の大腸菌液
（各試験管に約5ｍｌずつ入ってます）を四個のエッペンに
1.4ｍｌずつ加え、遠心（×15Ｋ）。
菌を底に落とす。これを4回行い、全ての菌を底に貯める。
3.「QIAprep Spin Miniprep Kit Protocol」なる英語の
説明書に従って、ミニプレを行う。
4.Resuspend pelleted bacterial cells in 250 μl Buffer
P1 and transfer to a microcentrifuge tube.
5.Add 250 μl Buffer P2 and gently invert the tube
4-6 times to mix.
6.Add 350 μl Buffer N3 and invert the tube immediately
but gently 4-6 times.
7.Centrifuge for 10 min at maximum speed in a tabletop
microcentrifuge.
8.Apply the supernatants from step 7 to the QIAprep
column by decanting or pipetting.
9.Centrifuge for 30-60s. Discard the flowthrough.
10.(Optional):wash theQIAprep spin column by adding
0.5 ml Buffer PB and centrifuging for 30-60s.
Discard the flowthrough.
11.Wash QIAprep spin column by adding 0.75 ml Buffer PE
and centrifuging for 30-60s.
12.Discard the flowthrough, and centrifuge for an
additional 1 min to remove residual wash buffer.
13.Place the QIAprep column in a clean 1.5 ml
microcentrifuge tube.To elute DNA, add 50 μl
Buffer EB(10 mM Tris-CL, pH8.5) or H2O to the
center of each QIAprep column, let stand for 1 min,
and centerfuge for 1 min.
14.ミニプレ終了。
15.この後、ミニプレの一部を取り、制限酵素処理して
電気泳動し、目的遺伝子が入っていることを確認しました。
16.ギガプレに移ります。
17.ギガプレ溶液（2Ｌ）を安否四厘終濃度100μｇ/ｍｌにする。
18.1で培養していた大腸菌液を2ｍｌギガプレに入れて37度で
培養開始。オーバーナイト。
19.終了
感想
疲れた。
うーーーーん！！！！
韓国勝っちゃったよ！！！
しかも２点もはいっちゃたよーーー！！！
もーね、こっちはすごかったよ。
実は今日試験があったから、どっか外でみる
っていうのはしなくて下宿の部屋でみていたんだけど、
けっこううちの下宿ははんかがいからちょうどはずれた
静かな住宅街にあるんだけど、点数がはいるたびに
大歓声があちらこちらできこえた。
となりの部屋に一度も話した事がないすんごく静かな
ひとがいるんだけど、そのとなりのへやからも
試合終了と同時に拍手。
試合がおわってちょっと繁華街にくりだしてみると
やはりあちらこちらで かったーーー！！
だの てーはんみんぐっく！！！ だの合唱。
友達の話だとそのあと地下鉄の駅周辺で学生達が
あつまってすごかったらしい。
なんていったてソウル一の学生街だからねー。
そんでもってテレビ。
試合終了まぎわには中継者が興奮して
えーみなさんもうすぐで歴史的瞬間がーーだの
４０年間まちつずけた瞬間がついにーーだのもーすごかった。
それと終わった後のテレビではもー監督のこれまでの
ドキュメントながして 韓国で一番重要な外国人だの
うーん、やっぱこれ前もって作ってたのかな？
それと、おもしろかったのが 映画俳優も応援といって
映画館で映画俳優が応援している姿をうつして
軍隊でも応援といって軍人が応援している姿がうつって
これで終わりかとおもいきや今度は
囚人も応援といって刑務所で囚人が応援している姿が
うつって、
今度は動物も応援ってくるかと思ったけどさすがにそれはなかった。
コメンテーターいわく
中国は泣いて、日本は惜しい思いをして、韓国が笑った
だとさ。うーん。もーなんか結果ができすぎだよねーー。
そんでもって日本ではどうなん？
引き分けでもこれ良い方なの？
今日は試験が終わってクラスのみんなとこれから
打ち上げでーす。
あまりできがよくなかったので沢山おさけのんで
カラオケでいっぱいうたいまーす。
あにょんはせよ。
引き分けで十分でしょ。
でもよーく考えてみると
やはりロシア戦も最低
引き分けを狙わなくては
いけないのかな。
目的
ミニプレを行うために
前日にまいた大腸菌を液体培地に植え継ぐ。
実験手順
1.5ｍｌの液体培地に安否四厘を終濃度が
100μｇ/ｍｌになるように入れる。
（四本の試験管にこれらを用意する）
2.シングルコロニーを竹串で突っつき、
5ｍｌの試験管液体培地に植え継ぐ。
3.次の日のギガプレ（2Ｌ）のために
液体培地を用意し、オートくれーブ。
4.終了。
感想
本当は、今日ミニプレを行うはずでしたが
液体培地に植え継いだ菌の培養速度が
予想以上に遅かったため、培養をオーバーナイトで
行うことにしました。