掲示板過去ログ

ＭＬで流した内容です。

５月の自主ゼミは来週金曜日の
午後から行うつもりです。

今のところ確定しているのは僕だけです。
まだ時間あるので、なにか発表したい人は
なんらかの反応をください。

しかーし、僕はさいGO研のゼミで17:00
からでないとできません。
ラストにまわしてもらって、その前に
何人かやってもらいたいのです。
（坂野研もゼミやってるようですが、割と
早くに終わっているようですね。）
人数が確定したら時間と教室を告知します。
だいたい15:00～と考えてよいのではないか、
と思います。

別に研究室でやっている内容にこだわる必要は
ありません。むしろ、皆が研究室のテーマと別の
テーマに関心を抱いている傾向があるように
思えます。

ちゅうことで、よろしく。
田中クン、↓の発表でもいいよ。

これから、日記がない日は
株式入門でもやろうかな。

ミーティング　　　　　　　　　　　　　　　　　　020517　四年　田中修平
研究テーマ
　Aminoacyl-transferase ribozyme(ATRib) とU1Aタンパク質の共結晶X線構造解析

背景・目的
　Aminoacyl-transferase(ATRib)とは、アミノアシル基をATRib自身に転移させた後、
ｔRNAに転移させることができる塩基数82のリボザイムです。今回、私はATRibとU
1Aタンパク質との共結晶を作り、X線結晶構造解析によってATRibの三次元構造を解明
することを試みます。U1Aタンパク質との共結晶を作る理由は、U1Aタンパク質がATRib
の負電荷を打ち消す効果があり結晶化を効率良く行うためです。

今まで実験したこと
・インサートチェック
　　　引継ぎでいただいたATRib-U1Aの鋳型DNAを含むpUC119プラスミドを制限酵
　　素SphⅠ（もし、ATRib-U1A遺伝子が入っていたら、その遺伝子の直後で切断する）
　　で処理し、アガロースゲル電気泳動で目的遺伝子の存在を確認しました。
・ミニスケール（50μｌ）
　　　T7由来のRNA polymerase の転写反応を、まずはミニスケールで反応の条件検討
　　を行いました。条件をプラスミド量（2μｇ、5μｇ）の2種類、転写反応時間（1h,
2h,4h)の３種類、使用する還元剤（DTT,TCEP）の２種類で分け、計12種類の試料
　　を用いて検討しました。Ureaゲル電気泳動の結果、プラスミド量5μｇ、反応時間
　　4h、還元剤DTTの試料がもっとも濃いバンドを示しました。
・転写反応（10ｍｌ）
　　　　ミニスケールの結果をもとに、反応時間４時間、還元剤DTTで転写反応を行いま
　　　した（37度）。４時間後、試料のマグネシウムイオン濃度を上げ、温度を５０度に上　　
　　　げてからもう２時間インキュベーションしました。これは、ATRibの下流で転写さ
　　　れたハンマーヘッドリボザイム（HH）を切断しました。
・ゲル精製
　　　
これからの実験
　　カラム精製します。
　　　　　　　　　　

一応、終わりました。
おやすみ。

ってゆうか、二分ももたない内容です。

レジュメよくできていたじゃないですか．ちゃんと卒研やってるじゃない．
岡部さんにびしびししごいてもらって
ください．

ビシビシってわけじゃないけどね。
失敗しながら、なんとかがんばってます。
このまえも
「タナカ君のRNAdyeは色が異常に濃い！」と言われ、
「ちゃんと言われた通り、作ったはずですが・・」と反論したものの
「10ｍｌに0.05％dyeを何グラム入れたの？」と聞かれ、すぐさま
「0.5ｇ入れたんじゃない？」と問われ、
「そうですよ」と答えた私は、すでに敗北していました・・・
岡部さんは鋭い女性です。

今日、研究発表だというのに
まだなにも書いてません・・・

目的
ゲル精製して、きれいなRNAを採る。

実験手順
1.泳動の電圧を700Vに上げて、泳動速度を上げる。

2.泳動をとめて、ゲルをサランラップではさんだ後、
　電気を暗くして、UVで目的のRNAバンドの場所に
　印をつけカッターでゲルを切り、んでもって、その
　ゲルを注射器に入れて50ｍｌコーニングに濾過する。

3.milli Qでゲルを溶かし、1時間放置。
　（ゲルからRNAを拡散させる。）

4.ゲルから飛び出たRNAに５時間、電気を流すことで
　ゲルから完全に分離させる。（まずは、高分子も
　低分子も通過させる紙をRNAが通過した後、
　半透膜でRNAのみを堰き止めるらしい。）

5.RNAをエタ沈。（これは、フウカンまではせずに
　零下80度に置いたところでオーバーナイト。RNAの
　場合は、零下80度に最低6時間は置かないと
　いけないらしい。）

6.終了

感想
発表どないしよ・・・

血を採られました。

目的
ゲル精製する。

実験手順
１．前日、冷凍保存しておいたやつに
　　等量（１０ｍｌ）の１０Ｍ酢酸アンモニウムを
　　加え、さらにその等量（２０ｍｌ）のイソプロパノールを
　　加え、振った後、室温で３０分間放置。

２．その後、２５度、８０００回転で３０分間遠心する予定が
　　間違えて、１５分間しかせず、後悔する。

３．遠心後、上清をすてて、ふうかんする。
　　ふうかん後、３ｍｌのミリキュウに沈殿物を
　　溶かし、さらに３ｍｌの２×RNAdyeを注ぎ、
　　後の泳動に備える。

４．ゲルを二枚作る。
　　アクリルアミド１０％ゲル溶液一枚分の作り方（１２０ｍｌ）
　　　アクリルアミド４０％溶液　３０ｍｌ
　　　１０×TBE　１２ｍｌ
　　　尿素　６０ｇ
　　　RO水で１２０ｍｌにメスアップ。
　　　APSを１２０ｍｇ溶かす。
　　具体的な作り方はまず、１２０ｍｌのうち、５ｍｌを
　　ブンチュウし、これにTEMED２０マイクロｌを加え
　　ゲル板に流し、下ゲルを作った後、残りのにTEMED３０マイクロｌを
　　加え、下ゲルの上に流し込み完成させる。

５．電気泳動のプレランを１時間する。

６．試料を加えた後、５００ｖで１２時間くらい
　　流す。

７．終了

感想
ねむい。

ぼくもねむい．
今週毎日学校に
とまっています．
まくらがないんだよなあ．
うちのを一個持ってこようかなあ．

横山研のお茶部屋にて
寝袋発見！！
これからは安心して
学校にとまれます。

3年生歓迎会に岩倉先生はこれないそうです。
そのメールの中に
研究室訪問はいつでも歓迎いたしま すので、ご希望の方はいつでもお越しください。
とあったので載せておきます。

歓迎会っていつ

こんなこといっていいのかしらないけど
IWA蔵先生ってなにやってるひと？
湾岸度はSAI10先生でしょ？
どこのひと？

医科研にいる生化の先生．うろ覚えだけどガンとかじゃなかったけ？

今日、セイカの事務（216）から
呼び出しを受け、行った所
三年生の初めに撮った集合写真が
総合図書館におちてたと伝えられました。

だれか4/17当たりに総合図書館で写真を
おとした人いませんかぁ？

きっとタナカくんのストーカーだよ．

マエダ先生、たちけて。

ノルウェーにまけるな！！

ゲルを染色液に落とす際、
ゲルが真っ二つに横に割れた・・・

目的
10ｍｌのラージスケールで
転写。

実験手順
1.前日切ったプラスミドを
　フェノクロ処理、エタ沈。

2.Transcription（10ｍｌ　scale）
　この前の50μｌスケールの時には、いれなかった
　Pyrophosphatase（0.5unit/μｌ）を20μｌを
　入れた。これは、二リン酸を一リン酸に分解することで
　Mg2+の働きを邪魔させないようにする役割を果たすらしい。

　37度で４時間インキュベーション。その後、260μｌ　
　MgCL2をいれて、次は50度で二時間インキュベーション。
　（四時間インキュベーション後に10μｌ試料を取っておき
　後でちゃんとRNAができているか、泳動でチェックした。）

3.その後、フェノクロ処理、零下20度で保存。

4.電気泳動はUreaゲルで二時間泳動。ただし、染色するとき
　北半球と南半球に分かれる・・・

考察
電気泳動は、ただRNAがしっかり転写されているか
みたかっただけなので、分断されたものの、なんとか
転写されてることが確認できたので、ノープロブレム。

感想
12時間労働は、疲れるけど
会社入ったら、12時間労働は当たり前なので
がんばるぞぉ！

4Fのエレベータを下りたところに名誉教授・職員から学部3年まで天文学科全員の顔写真が張ってあった。
なぜか3年生が4年生の半分しかいない。

血抜きは明日であります。

時間は10:00-11:30です。
早めに行った方がいいかも。

ふつうの健康診断は来週からです。